外周血干细胞(骨髓)移植现状

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　　PBSCT Periphery blood stem cell transplantation丽水市人民医院血液科方炳木
　　
　　摘要：外周血造血干细胞移植（PBSCT）是造血干细胞移植的一种，又分为自体PBSCT和异基因PBSCT。本文就外周血干细胞/祖细胞的检测要领、常用的带动要领以及自体PBSCT中的净化问题，异基因 PBSCT与异基因骨髓移植的黑白和非血缘PBSCT做一个简要介绍。FM认证
　　
　　一、 提要

　　近几十年来，跟着临床与尝试血液学及相关学科的迅速成长，出格是对造血干细胞特性及造血与调控的深入研究，人们对移植免疫学的深入认识，人类白细胞抗原（HLA）配型技术的进展、血液成品及抗生素等支持疗法的进展、全情况掩护治疗的应用出格是血细胞疏散机及多种造血细胞发展因子的遍及应用，极大的敦促了外周血造血干细胞移植的迅猛成长，现已成为治疗白血病、部门恶性实体瘤等的主要治疗方法之一。

　　目前，造血干细胞移植按造血干细胞来源可分为

　　（1）骨髓移植

　　（2）外周血造血干细胞移植（PBSCT）

　　（3）胎盘/脐带血造血干细胞移植。

　　按移植物免疫学特征可分为

　　（1）自体移植（auto-SCT）

　　（2）异基因移植（allo-SCT）

　　（3）同基因移植（syn-SCT）

　　（4）异种移植（Xeno-SCT）。
　　
　　外周血造血干细胞移植（PBSCT）是造血干细胞移植中的一种，又可分为自体PBSCT（auto- PBSCT）、异基因PBSCT（Allo-PBSCT）。主要通过收罗经过带动后的外周血中的造血干/祖细胞作为移植物移植给受者，使其成立起正常的造血与免疫成果，与骨髓一样，收罗到的外周血中的血细胞身分包罗种种造血祖细胞、各个分化阶段的血细胞及成熟的血细胞。
　　
　　二、 外周血造血干细胞移植历史
　　
　　早在60年代初期，人们在为化疗后的细胞减少患者输注人体的细胞时，偶然发此刻输注慢性髓性白血病（CML）患者外周血后呈现一过性ph染色体阳性细胞，从而提示外周血中含有造血干细胞。1975年Richman发明化疗后恶性实体肿瘤患者化疗后，外周血中造血细胞集落形成细胞呈一过性增加。1977年Goldman等对CML患者收罗未经带动的外周血造血干细胞并冷冻生存，在患者急变后行的外周血造血干细胞移植，开创了外周血造血干细胞移植的先河。1980年Rich为一例严重联合免疫缺陷患者进行异基因外周血造血干细胞移植。80年代后期，跟着血细胞疏散技术的改造，造血细胞因子（如 G-CSF、GM-CSF)的临床应用，造血干细胞的迅速成长，PBSCT得以迅速成长。我国在 1989年首先开展了auto-PBSCT，1996年乐成开展了异基因外周血造血干细胞移植。
　　
　　三、外周血造血干/祖细胞的检测要领
　　
　　收罗、输注足够数量的造血干/祖细胞是担保PBSCT乐成的重要环节。因此，准确评价收罗物中造血干/祖细胞的数量也是PBSCT中的要害问题之一。
　　
　　1、造血细胞体外集落形成单元的测定
　　
　　通过体外半固体培养的要领测定造血干/祖细胞集落形成单元。常用的为粒-单系集落形成单元（CFU-GM，colony forming units-granulocyte-macrophage），目前多回收甲基纤维素法测定。简而言之，将收罗到的单个核细胞（MNC）洗净两次，培养细胞数以2X103- 2X104个为宜，在0.8Gv/v甲基纤维培养体系中，插手小牛血清，适合浓度的细胞因子（GM-CSF），也可插手其他细胞因子（如IL-5，IL-6，SCF等）如要培养CFU-mix，可加Epo、Tpo 等，在CO2培养箱中培养14天，计数集落数。凡是PBSCT所需CFU-GM数为≥2X105/kg。
　　
　　2、Long-term culture-initiating cells(LTCIC)的测定
　　
　　将收罗的MNC与骨髓基质细胞配合培养、培养4到5周，然后再行甲基纤维素法培养，计算出 LTC-IC，LTC-IC是能够检测到最接近造血干细胞的早期祖细胞检测要领。改善的LTC-IC培养要领将培养时间耽误8周，可以获得更为接近造血干细胞的祖细胞。由于LTC-IC培养时间长，操纵繁琐，目前临床较少作为PBSCT时检测造血干/祖细胞的要领。
　　
　　3、CD34+细胞测定
　　
　　CD34是80年代中期发明的一种细胞外貌分子，在未成熟的造血细胞及所有具有造血潜能的集落形成细胞上表达。CD34+细胞在正凡人骨髓MNC中约占1-4％，未经带动的外周血MNC中约为0.2％，带动后的外周血MNC中可达1％。临床应用功效证明，输入必然量的CD34+ 细胞，可恒久重建造血。同时输入的CD34+细胞数同移植后造血植活速度呈正相关。最近有报道认为CD34-细胞可能更接近造血干细胞，但目前临床上仍回收已被实践证明的 CD34+细胞数作为造血干/祖细胞的测定指数。
　　
　　由于CD34+细胞在骨髓、外周血及脐带血中含量均低、加之影响测定功效的因素较多，如标本制备历程中是直接标志全血，照旧MNC，是否洗涤，CD34抗体种类的差异及阐明要领差别等均可影响CD34+功效，造成测定功效的准确性和可反复性较差。
　　
　　基于上述原因，国际上已提出几种尺度化方案。个中之一是国际血液治疗与移植工程方案（ISHAGE），回收4个参数：CD34-PE、CD45-FITC、SSC和FSC，用累积设门法阐明，检丈量少， 75000个CD45+细胞及100个CD34+细胞。
　　
　　另一种为三色方案，引用一种称为7-AAD的核酸染料撤除死细胞、另外两种荧光别离为CD14- FITC和CD34-PE，同时设同型比较，依据FSC和SSC确定有核细胞。其商品化试剂盒为Procount，该试剂盒不单可测出CD34+细胞占有核细胞的百分比、还可测出CD34+细胞绝对数。北京大学人民医院用Procount检测脐带血和外周血CD34+细胞，可极大减少在处理惩罚技术与阐明中工钱误差，是一种较好的CD34+测定要领。

　　四、外周血造血干细胞的带动
　　
　　在不变的造血环境下，人外周血中仅有少量造血干/祖细胞存在，不能满足PBSCT的需要，因此，如何增加外周血造血干/祖细胞数量, 即带动出足够数量的造血干/祖细胞，担保PBSCT乐成、是PBSCT技术中的重要环节，也是PBSCT有别于骨髓移植之处。
　　
　　常用造血干细胞的带动要领：
　　
　　1、化疗药物
　　
　　骨髓抑制性细胞毒药物化疗后，在骨髓造血成果规复期，外周血造血干/祖细胞呈一过性增加，此时用血细胞疏散机可收罗到足够数量的造血干/祖细胞。常用于很多恶性肿瘤性疾病auto- PBSCT的带动。该要领是第一种被临床遍及应用的外周血造血干细胞带动要领。又分为大剂量单一药物和联适用药两种方法。(1)单一药物中以大剂量环磷酰胺为最常用的要领，凡是为4- 7g/m2。别的另有大剂量足叶乙甙、阿糖胞苷等；(2)联合化疗，也是一种常用的带动要领。按照差异疾病选择相应的联合化疗方案，如AML患者回收TAD方案（柔红霉素+阿糖胞苷+6-巯鸟嘌呤）；多发性骨髓瘤的CAVB方案（环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松）；淋巴瘤的CHOP方案（环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松）等。
　　
　　上述方案各有优缺点，如单一药物要领，骨髓抑制强度大易引起因白细胞减少造成的传染、血小板减少引起的出血。同时单一化疗可能倒霉于原有肿瘤疾病的固定治疗。联适用药时骨髓抑制的强度不等，有可能带动不出足够数量的造血干/祖细胞、从而造成带动失败。总之，化疗药物带动外周血造血干/祖细胞时，其化疗方案需到达足够强的骨髓抑制水平，才可担保带动的乐成；而对付那些接受过重复多次化疗或其他因素所致的骨髓成果衰竭者，往往带动不出足够数量的PBSC。别的，该要领带动效率不高、常需疏散3-4次，且自己副感化较大，目前临床上还很少使用。

　　2、造血细胞刺激因子

　　80年代以来，人们发明很多造血细胞刺激因子，包罗集落刺激因子（如G-CSF，GM-CSF，M- CSF）及IL-3、IL-6、IL-8、SCF等，具有更强的PBSC带行动用，具有毒副感化低、带动效率高的特点, 是目前临床上不行缺傲幽带动要领，主要用于Allo-PBSCT对健康供者的带动及部门恶性肿瘤患者。

　　常用的带动剂为G-CSF，在健康供者带动中, 以剂量5-16ng/kg的G-CSF, 持续供应5-6天, 收罗 l-3次、即可收罗到足够数量的PBSC。别的, 单独应用GM-CSF或G-CSF、GM-CSF联合也有临床应用的报道，以G-CSF带动要领最为常用。

　　3、化疗联合造血细胞刺激因子

　　该要领是前述两种要领的结合，是目前临床上Auto-PBSCT治疗恶性肿瘤患者最为常用的带动要领。其长处在于既可通过化疗药物进一步杀灭体内残存肿瘤细胞, 又可带动出更大都量的PBSC, 出格是回收增加环磷酰胺剂量的CHOP方案联合G-CSF的带动要领，已成为带动淋巴瘤患者PBSC的最为常用的要领。

　　五、Auto-PBSCT

　　Auto-PBSCT的道理与自体骨髓移植沟通，其实质是大剂量化疗杀灭体内的肿瘤细胞，同时也将骨髓造血系统摧毁，再将大剂量化疗前收罗的PBSC回输给患者本人。Auto-PBSCT的PBSC来源于患者本人，不受HLA配型相和供者的限制，移植后无GVHD等并发症。因此移植相关死亡率远低于Allo- PBSCT，小于10％，目前主要合用于对放/化疗敏感的恶性肿瘤患者。如淋巴瘤、急性白血病、部门恶性实体肿瘤（乳腺癌、卵巢癌、肝癌、神经母细胞瘤），别的非恶性疾病、严重自体免疫性疾病如类风湿性枢纽炎、系统性红斑狼疮等。据IBMTR统计，在接受Auto-PBSCT治疗病种，淋巴瘤占第一位，其次是急性白血病。

　　Auto-PBSCT与自体骨髓移植对比，具有如下长处：（1）收罗比力方便，收罗PBSC时无需麻醉，也无需多部位穿砭骨髓抽髓引起的痛苦。（2）对付部门侵犯骨髓的患者和多发性骨髓瘤的患者，由于骨质粉碎或肿瘤细胞浸润骨髓，及骨盆局部放疗等原因无法收罗骨髓时，可收罗PBSC。（3）移植后造血成果规复快，移植后传染、出血等并发症少，减少了抗生素和身分输血的应用，降低了移植相关死亡率。缩短了住院时间，节减了用度。（4）与骨髓对比，外周血中肿瘤细胞混入的少。有资料显示，对多发性骨髓瘤、淋巴瘤及一些实体肿瘤患者收罗的PBSC中检测功效表白：固然收罗的PBSC中并不能完全制止肿瘤细胞的污染，但其检出率低于骨髓。最初人们曾设想PBSC中肿瘤污染少，Auto-PBSCT可降低复发率。但现有资料表白Auto-PBSCT后的复发率并不比自体骨髓移植少。

　　Auto-PBSCT的最大问题是移植后复发率高，是导致移植失败的最主要原因。因此，如何降低移植后复发率，是提高Auto-PBSCT恒久保留率的要害地址。除了加强移植前的化疗以减轻肿瘤负荷，改造预处理惩罚方案，以便最大限度地杀灭体内残存的肿瘤细胞，及体内净化外，对移植物的体外净化进行了大量研究事情。体外净化的要领包罗阳性选择和阴性选择，前者是筛选出造血干/祖细胞，也就是CD34+细胞选择,后者为去除收罗物中的肿瘤细胞。
　　
　　目前研究的要领较多，但临床应用的要领较少。

　　1、物理学要领：
　　
　　按照肿瘤细胞和正常造血细胞之间的巨细、密度、对温度的敏感性等物理学特性到达净化的目的，包罗密度梯度离心、冷冻、淘洗、高温等要领。由于净化效果不佳，现已较少回收。近来回收光敏剂（MC-450）可杀灭肿瘤细胞4-5个对教级，对正常造血细胞杀伤少，是一种有前途的净化要领。

　　2、药物：

　　操作某些药物对肿瘤细胞和正常造血干细胞的杀伤存在较大差此外特点，如4-羟环磷酰胺（4-HC）等，有作者比力了经4-HC净化与非净化自体骨髓移植治疗急性髓性白血病的疗效，前者实际无病保留率为51％；后者仅为32％。别的，EBMTR报道了经磺乙硫环磷酰胺（Mafostamide, MFD）净化自体移植治疗淋巴瘤疗效优于未净化的自体移植。为减少净化药物对正常造血细胞的影响，人们实验应用细胞掩护剂共同细胞净化。如Amifoscine是一种磷酸化氨基脂类原药，经碱性磷酸酶磷酸化后生成活性代谢产品，它能够选择在正常细胞中堆积，增加4-HC或MFD对肿瘤细胞的毒性，回收上述要领共同净化，移植后可缩短造血规复的时间。其他用于净化的药物另有足叶乙甙、维拉呱咪等。

　　3、免疫学要领：

　　是目前研究的重点之一，它是回收针对肿瘤细胞与正常造血细胞外貌抗原的差别，将肿瘤细胞特异性抗体选择性结合在肿瘤细胞上，加以清除。常用的有（1）补体依赖的细胞毒法：单抗与相应靶细胞结合后再插手补体，通过激活补体经典途径使靶细胞溶解粉碎，到达净化目的。有文献报道，回收多种B细胞单抗（CD9、CD10、CD19、CD20）或T细胞抗体（CD2、CD3、CD4、CD5等）联合补体体外净化骨髓治疗急性淋巴细胞性白血病，3年DFS为41％，未净化组为26％。别的，有作者应用 AML-223（抗CD14单抗）加免疫补体净化治疗急性髓性白血病，取得了与Allo-骨髓移植相似的疗效。（2）免疫毒素介导的细胞毒法，此法是将特异性抗体与细胞毒素（蓖麻毒素）结合制成免疫毒素，即有强大的杀灭肿瘤效应，又有特异性。（3）免疫物理法，用单抗包被微球体或金属颗粒，标志靶细胞后使细胞密度增加或发生磁性、再通过沉淀或磁场吸附要领清除靶细胞。上述要领各有利弊，目前临床上主要用于淋巴细胞性疾病的净化。

　　4、CD34+细胞选择法：

　　除部门造血系统恶性肿瘤外，其他绝大部门恶性肿瘤不表达CD34抗原。

　　通过选择CD34+细胞到达去除肿瘤细胞的目的。现已成为一种新的较有前途的体外净化要领，常用的有亲和柱层析，疏散和免疫磁珠法。通过特异性识别、俘获及洗脱疏散获得 CD34+细胞。（1）亲和柱层析是将预分选的收罗物生物素化（biotinglated）的抗 CD34抗原的单抗一起孵育，然后洗去未结合的抗体，通过抗生物素卵白包被的聚丙酰胺柱的亲和柱，使CD34+细胞留滞在柱内的聚丙酰胺外貌上，再经机械摇动，冲洗出 CD34+细胞。Cellpro公司出产的CD34+细胞分选仪就是基于这种道理设计的，现已应用于临床不单可以做自体净化，亦可在Allo-PBSCT中去除T细胞。（2）免疫磁珠疏散法：将 CD34单抗标志细胞后，直接或间接与超顺磁性微球连接、通过强磁场中的过滤柱时，阳性细胞被吸附，阴性细胞被滤掉。近来，为克服本来磁性微球大的缺点(直径45um)，研制出了纳米微粒作为固相收集CD34+细胞。通过将收罗物与抗CD34抗原的单抗结合，细胞特异地被超顺磁铁－葡聚糖纳米（直径50nm）微球结合，使CD34+细胞与纳米微球形成复合物，再通过一个永久磁铁诱导的强磁场过滤柱，疏散出CD34+细胞。Amgen公司研制的 CliniMACS系统就是这种应用于临床的装置，其CD34+细胞接纳纯度＞95％, 接纳率67% 以上。

　　六、Allo-PBSCT

　　自1989年Allo-PBSCT治疗急性淋巴细胞性白血病得到乐成以来,因其具有收罗外周的造血干细胞无需麻醉、简单易行、移植后造血成果规复迅速等长处，日益受到人们的重视。固然Allo-PBSCT具有上述长处，但在目前尚不能代替Allo-BMT。我国于1995年乐成进行Allo-PBSCT。

　　1、健康供者外周血的造血干细胞带动与安详性

　　对健康供者的PBSC带动常用剂量为10ug/kg/天，固然CD34+细胞的带动效率与G- CSF剂量有关，但凌驾10ug/kg/天并不能使得CD34+细胞增加很高。目前欧洲造血干细胞移植协作组（EBMT）和美国国度供者打算（NMDP）都建议G-CSF用量为10ug/kg/天。凡是G-CSF给药4-6天，CD34+细胞在第5或第6天达峰值(peak)，第7天以后，CD34+细胞有下降的趋势。因此，目前多在第4-6天之间收罗1-2次。方针收罗量一般为4- 5X106/kg，也有1X106/kg可以植活的报道。

　　关于健康供者的安详性，有两方面的内容：（1）G-CSF对健康供者的安详性；(2)收罗时的安详性。G-CSF的安详性分为近期和远期两类。近期副感化最常见为骨痛，其他有发烧、头痛、恶心、呕吐、全身不适等。一般停药后可迅速消失。血生化检查可有碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶轻度升高，钠、镁离子轻度降低，停药后均可规复。血象中除有白细胞增高外；常有血小板减少，其原因与收罗有关。但也有未行收罗即可呈现血小板减少。同时G-CSF可引起血小板堆积成果亢进，并有引起心肌梗塞、脑血管病的报道。关于G-CSF的远期副感化，目前尚不清楚，需要大量病例恒久随访10年才气得出结论。有个体报道非肿瘤性疾病患者，恒久使用G-CSF后呈现染色体异常、呈现骨髓增生异常综合征（MDS）的报道。亦有健康供者5年后呈现染色体异常的报道。但美国西雅图陈诉随访调查3-6年, 未发明G-CSF的副感化。PBSC收罗的副感化主要有ACD-A大量使用时所致的ACD中毒引起低钙，呈现恶心、呕吐、手足抽搐等，可用钙剂拮抗。如需大量收罗时，可联合肝素以减少 ACD-A的用量。

　　2、Allo-PBSCT后的GVL效果

　　Allo-PBSCT与Allo-BMT对比具有以下特点:（l）输入的CD34+细胞数远多于骨髓，（2）T细胞数亦高于骨髓10-20倍，(3)经G-CSF带动后输入的T、单核细胞特性差异于未经G-CSF带动的骨髓中的T细胞和单核细胞。

　　Allo-PBSCT输入大量T细胞的功效，使得由淋巴细胞介导的免疫成果得以迅速规复。曾有人担忧输入大量T细胞会导致急性GVHD产生率与严重水平加重，但事实上与Allo-BMT相似。另一方面，慢性 GVHD的产生率有所增加。有作者认为慢性GVHD与GVL密切相关。西雅图研究小组进行了Allo-BMT与 PBSCT的随机比拟研究，认为BMT较PBSCT复发率高，个中高危组PBSCT复发率低于BMT。英国的研究功效也支持这种概念。但法国的研究功效认为两者之间无显著性差别。以上功效表白，至少在高危组、Allo-PBSCT的复发率低于Allo-BMT。

　　3、非血缘干系PBSCT（UPBSCT）现状

　　自70年代后期开展非血缘干系BMT（UBMT）以来，现全世界已有凌驾500万人活着界各地的非血缘关案骨髓资料库中挂号。近年来回收G-CSF带动PBSC进行UPBSCT的病例数亦在逐年增加。UPBSCT 开始是用于第一次UBMT后复发或排斥的患者，进行第二次移植，此刻第一次移植也选用UPBSCT。与 UBMT对比力，UPBSCT时：（1）PBSCT时输入的CD34+细胞数较多，移植后造血成果规复迅速，出格是血小板规复迅速；（2）急性GVHD的产生率与严重水平两者相似。但UPBSCT的慢性 GVHD的产生率增加。别的，造血的迅速规复可降低移植相关死亡率。由于UPBSCT后慢性GVHD增加，相应地GVL也增强，有可能提高一些疾病晚期患者移植后的保留率。